Endüstriyel enzimler üreten Bacillus izolatlarının morfolojik, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu

GİRİŞ ve AMAÇ: Bacillus cinsine ait türlerin tanımlanmasında türler arasındaki moleküler benzerliklerin fazla olması nedeniyle ayrım zorlaşmaktadır. Bu çalışma kapsamında, özellikle birbiriyle yakın akraba olan gruplar arasında karşılaştırma yaparak türlerin karakterize edilmesi amaçlanmıştır. Moleküler tanımlanması yapılan ve fenotipik özellikleri belirlenen izolatların endüstriyel kullanımları da ayrıca irdelenmiştir.
YÖNTEM ve GEREÇLER: Kocaeli ilinin farklı bölgelerinden (Kocaeli Üniversitesi Kampüsü, Yuvacık Baraj Yolu üzerindeki tarlalar ve dere kenarı, Kent Ormanı) alınan toprak örnekleri; pastörizasyon işleminden sonra seri seyreltmeler hazırlanarak, nutrient agar plaklara yayma ekim yapılmıştır. Bacillus benzeri koloniler morfolojik karakterlerine göre tek tek seçilip, tekrar yayma ekimle saflaştırılmış ve numaralandırılmıştır. Bacillus cinsine ait olanlarda önce korunmuş bir gen bölgesi olan ve sınıflandırmada yaygın olarak kullanılan 16S rRNA (16S rDNA) gen dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Yakın akraba olanları birbirinden ayırmak için ilave moleküler (gyrB gen bölgesinin Sau3AI enzimi ile muamele edilmesi) ve biyokimyasal (seçici besiyerlerinde gelişme) analizler yapılmıştır. Filogenetik analizler NJ (neighbour joining) metodu ile gerçekleştirilmiştir. İzolatlar ayrıca fizyolojik özellikleri açısından karşılaştırılmıştır.
BULGULAR: İzolatlara ait 7 farklı Bacillus tür (Y1: B. cereus, Y7: B. pumilus, Y12: B. megaterium, Y13: B. methylotrophicus, Y15: B. subtilis, Y35: B. licheniformis ve Y38: B. sonorensis) tanımlanmış ve her bir izolatın fizyolojik özellikleri kaydedilmiştir. Buna göre tüm izolatlar 30 ila 45°C sıcaklık aralığında ve pH’sı 9 olan besiortamında gelişme göstermiştir. Diğer yandan Y7, Y15, Y35 ve Y38 numaralı izolatlar 50°C’ye kadar olan sıcaklıklarda büyüme yeteneklerini korumuşlardır. Aralarında tuza en fazla tolerans gösterenin B. licheniformis olarak tanımlanmış olan Y35 numaralı izolat olduğu gözlenmiştir. Bu izolat yaklaşık %12 (w/v) oranında tuz içeren ortamda gelişebilmektedir. Tuza karşı duyarlılığı en fazla olan izolatlar ise B. cereus ve B. megaterium olarak tanımlanan Y1 ve Y12 numaralı izolatlar olup büyümelerinin %5’lik (w/v) NaCl’da durduğu kaydedilmiştir.
TARTIŞMA ve SONUÇ: Yapılan bu çalışmada izolatların tür tanımlanması için seçilen 16S rRNA ve gyrB gen bölgelerinin, Bacillus’ların moleküler düzeyde ayırımında kullanılabileceği gösterilmiştir. Gerçekleştirilen biyokimyasal testler, moleküler analiz bulgularını desteklemiştir. İzolatların sıcaklık, pH ve tuz toleransları endüstride hali hazırda kullanılan Bacillus’larla karşılaştırılmış ve birçoğunun benzer fizyolojik koşullarda gelişme gösterdiği gözlenmiştir. Diğer yandan, izolatlardan Y1’in literatürde rapor edilen benzer suşlardan daha geniş bir pH aralığında gelişme gösterdiği bulunmuştur. Y35’de gözlenen yüksek tuz konsantrasyonu (%12, w/v) içeren ortamlarda gelişebilme yeteneği ise toprak Bacillus’larında ilk defa bu çalışmada sunulmuştur. Sonuç olarak, Y1 ve Y35 başta olmak üzere tür tanımlaması yapılan tüm izolatların endüstriyel biyoteknoloji alanında özgün enzim ya da toksin üretimi, ilaç ham madde sentezi gibi veya benzeri çalışmaların yapılmasına olanak sağlayabilecekleri düşünülmektedir.

Morphological, biochemical and molecular characterization of Bacillus isolates as a producer of industrial enzymes

INTRODUCTION: The identification of Bacillus strains which are genetically related have become difficult. The aim of this study was to characterize the closely related groups of species by making comparisons. The industrial use of isolates that have been identified by molecular methods and their phenotypic properties documented have also been examined.
METHODS: Soil samples were collected from different locations in Kocaeli town (Kocaeli University Campus, fields and creeks on Yuvacık Dam Road, Kent Forest), spread onto nutrient agar plates after pasteurization process followed by serial dilutions. Bacilli-like colonies were isolated according to their morphological characters. Individual colonies from each site were picked up, purified by re-streaking and numbered. The biochemical characteristics of the isolates were compared with the reference strains. In this study, we used the gene sequences, 16S rRNA and gyrB, to differentiate bacterial strains at molecular level and to discriminate the members of closely relaxed taxa, respectively. Phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method.
RESULTS: 7 different isolates (Y1; B. cereus, Y7; B. pumilus, Y12; B. megaterium; Y13; B. methylotrophicus, Y15; B. subtilis, Y35; B. licheniformis, Y38; B. sonorensis) have been identified to species level and physiological characteristics of each have been documented. Accordingly, all isolates were able to grow at temperatures from 30 to 45°C and pH 9. The isolates numbered as Y7, Y15, Y35 and Y38 were observed to tolerate temperatures up to 50°C. Among all, B. licheniformis numbered as Y35 presented the highest tolerance to salt concentration of 12% (w/v). The most sensitive ones to salt were B. cereus and B. megaterium numbered as Y1 and Y12, respectively.
DISCUSSION AND CONCLUSION: The 16S rRNA and gyrB genes, selected to identify the isolates, have been proven to be used for classification of Bacilli at molecular level. Biochemical tests confirmed the molecular analysis outcomes. Temperature, pH and salt tolerance of the isolates were compared with the Bacillus species already used in industry. Many of them presented similar growth potential against to the physiological conditions tested. On the other hand, the isolate Y1 was found to show ability to grow broad pH range than those reported for B. cereus. The capability of a soil B. licheniformis, isolate Y35, to grow in medium with high salt (12%, w/v) was presented for the first time. In summary, the isolated and identified Bacillus species here are believed to promote many studies including novel enzyme, toxin and pharmaceutically important compound production in industrial biotechnology field.