Applicability of Rotavirus Existence in Drinking Water Samples with EPA 1615 Method

INTRODUCTION: Gastroenteritis particularly affects children under the age of 5 worldwide. In case of an epidemic, determining the source of the epidemic in a short time and accurately is of great importance for the protection of the public health. In this study, it is aimed to demonstrate the applicabilitiy of the EPA 1615 method, which is an international standard method.
METHODS: In the study, firstly 10 L of water sample was contaminated with Rotavirus isolate extracted from clinical samples. Afterwards, adsorption process was performed for the contaminated water sample. The adsorption process was achieved by using NanoCeram® (Argonide, U.S.A.) filter. Contaminated water sample was eluated after the adsorption process. The elution process was performed by using Beef Extract solution. Organic flocculation was applied to the eluted water sample. Before the organic flocculation process, the pH value of the eluate was adjusted to the defined value in the EPA 1615 standard. After the organic flocculation step, the pH value of the supernatant was adjusted again. Concentration process was completed by centrifugating supernatant in the 30.000 MWCO tubes. Then, viral RNA isolation was applied to the concentrated water sample. For this purpose, viral RNA isolation method defined by the EPA 1615 standard is accompolished with the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Crawley-UK). The amplification of the isolated viral RNA sample was performed using the RealStar® Rotavirus RT-PCR Kit 1.0 (Altona Diagnostics GmbH, Germany) using the Qiagen Rotor-GeneQ device according to the manufacturer's instructions.
RESULTS: Adsorption-elution, centrifugation, viral RNA isolation and RT-PCR steps were respectively applied to 10 L of water samples inoculated with Rotavirus dilutions.
When the results of drinking water samples which were inoculated with three different dilutions of rotavirus are evaluated together, rotavirus presence can be detected by EPA 1615 Standard method. Additionally in this study, it was determined that Ct values increased according to decreasing rotavirus concentration values, in accordance with the principle of RT-PCR process.

DISCUSSION AND CONCLUSION: According to the results obtained with drinking water samples contaminated with three different concentrations of rotavirus strain, EPA 1615 Standard was shown to be applicable in water samples analyzed in the laboratory.

İçme-Kullanma Sularında Rotavirüs Varlığının EPA 1615 Yöntemi İle Tespitinin Uygulanabilirliği

GİRİŞ ve AMAÇ: Gastroenteritler, dünya çapında özellikle beş yaş altı çocukları etkileyen ve ölümlere sebep veren önemli bir hastalık olup salgın durumunda salgın kaynağının kısa sürede ve doğru bir şekilde tespitinin yapılması halk sağlığının korunması açısından büyük önem arz etmektedir. Bu çalışmada uluslararası standart bir yöntem olan EPA 1615 yönteminin uygulanabilirliğinin gösterilmesi amaçlanmıştır.
YÖNTEM ve GEREÇLER: Çalışmada ilk olarak, 10 L su örneği, klinik örneklerden izole edilmiş Rotavirüs izolatı ile kirletilmiştir. Daha sonra Kirletilmiş su örnekleri adsorbsiyon işlemine tabi tutulmuştur. Adsorbsiyon işlemi NanoCeram® (Argonide, U.S.A.) filtre kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kirletilmiş su örneği adsorbsiyon işlemi sonrası elüe edilmiştir. Elüsyon işlemi Beef Extract solüsyonu kullanılarak yapılmıştır. Elüsyon işlemi tamamlanan su örneğine organik flokülasyon işlemi uygulanmıştır. Organik flokülasyon işlemine geçmeden önce elde edilen elüatın pH değeri EPA 1615 standardında belirtilen değere ayarlanmıştır. Organik flokülasyon işlemi sonucunda elde edilen süpernatanın pH değeri tekrar ayarlanmıştır. Süpernatan, 30.000 MWCO tüpler ile santrifüj edilerek yoğunlaştırma işlemi tamamlanmıştır. Santrifügasyondan sonra elde edilen yoğunlaştırılmış su örneğine viral RNA izolasyonu uygulanmıştır. Çalışmada viral RNA izolasyonu, QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Crawley-UK) ile EPA 1615 standardının tanımladığı şekilde gerçekleştirilmiştir. İzole edilen viral RNA örneğinin amplifikasyon işlemi ise The RealStar® Rotavirus RT-PCR Kit 1.0 (Altona Diagnostics GmbH, Germany) kullanılarak üretici firmanın talimatları doğrultusunda Qiagen Rotor-GeneQ cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
BULGULAR: 10 L su örneğine eklenen rotavirüs izolat dilüsyonlarına sırası ile adsorbsiyon-elüsyon, santrifügasyon, viral RNA izolasyonu ve RT-PCR (Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir reaksiyonu) işlemleri uygulanmıştır. Üç farklı rotavirüs dilüsyonu ile kirletilen içme-kullanma su örneklerine ait analiz sonuçları birlikte değerlendirildiğinde; EPA 1615 Standart yöntemi ile rotavirüs varlığı tespit edilebilmiştir. Ayrıca çalışmamızda RT-PCR çalışma prensibine uygun olarak, azalan rotavirüs konsantrasyon değerlerine göre cycle threshold (Ct) değerlerinin de yükseldiği belirlenmiştir.
TARTIŞMA ve SONUÇ: Rotavirüs suşunun üç farklı konsantrasyonu ile kirletilen içme-kullanma su örnekleri ile elde edilen sonuca göre EPA 1615 Standardının laboratuvarda analiz edilecek su numunelerinde uygulanabileceği gösterilmiştir.