Turk Hij Den Biyol Derg. 2025; 82(2): 311-322 | DOI: 10.5505/TurkHijyen.2025.30806

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında bakteriyel tanımlama için 16S rRNA dizileme yöntemlerinin karşılaştırılması: Sanger dizilemesi ve üçüncü nesil dizileme

Süleyman YALÇIN¹, Ayşe Hande TÜRK¹, Hakan Farzin MEHMETZADE¹, Safa Kerem AYDIN³, Ekrem SAĞTAŞ^2
1Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı, Ankara
²Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü,mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Ve Biyolojik Ürünler Dairesi Başkanlığı, Ankara, Türkiye
³Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Fakültesi, Ankara, Türkiye

GİRİŞ ve AMAÇ: Bu çalışma, Sanger dizileme ve üçüncü nesil 16S rRNA sekanslama yöntemlerinin, aynı primer ve belirli PCR koşulları altında dört Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (ATCC) suşu kullanılarak doğru şekilde bakterileri tanımlama yeteneklerini karşılaştırmalı olarak değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu bağlamda, her bir yöntemin, cins ve türleri önceden doğrulanmış ve bilinen saf kültürlerden bakterileri doğru ve kapsamlı bir şekilde tanımlama kapasitesi değerlendirilmiştir.
YÖNTEM ve GEREÇLER: Çalışmada, iki farklı sekanslama yönteminin karşılaştırılabilmesi amacıyla aynı primer setleri ve PCR koşulları kullanılmıştır. Sanger dizileme yönteminde 16S rRNA bölgesini kapsayan sekiz primer kullanılırken üçüncü nesil 16S rRNA sekanslama yönteminde aynı bölge için 2 primer kullanılmıştır. Ham veriler, Sanger Dizilemede GeneStudio yazılımında, üçüncü nesil 16S rRNA sekanslama yönteminde ise uygun biyoinformatik iş akışı ile analiz edilmiştir.
BULGULAR: Analiz sonuçları, üçüncü nesil 16S rRNA sekanslama yönteminin Sanger dizilemeden daha kapsamlı ve verimli bir şekilde tam 16S rRNA bölgesini profilleyebildiğini göstermiştir. Üçüncü nesil 16S sekanslama yöntemi, primer gereksinimlerini azalttığı ve primer bağlanma bölgelerinde dizi kaybını en aza indirdiği gibi, işlem süresini günlerden saatlere düşürerek dakikalar içinde hızlı, yüksek verimli dizileme olanağı tanımaktadır. Buna karşın, Sanger dizilemenin tek okuma doğruluğu yüksek olmasına rağmen, uzun işlem süresi ve düşük verimliliği nedeniyle geniş kapsamlı uygulamalar için daha az uygun olduğu belirlenmiştir.

TARTIŞMA ve SONUÇ: Bu çalışma, üçüncü nesil 16S sekanslama yönteminin yüksek çözünürlüklü mikrobiyal analizler için daha hızlı, daha kapsamlı ve daha etkili bir seçenek olduğunu ortaya koymaktadır. Sanger dizileme, yüksek tek-okuma doğruluğu sayesinde belirli durumlarda hâlâ değerli bir araç olarak kabul edilse de, yavaşlığı ve sınırlı kapsama alanı nedeniyle daha geniş uygulamalar için yetersiz kalmaktadır. Elde edilen bulgular, üçüncü nesil 16S sekanslama yönteminin mikroorganizmaların karakterizasyonunda güvenilir ve ayrıntılı bir yaklaşım sunduğunu vurgulamakta ve çeşitli mikrobiyal uygulamalarda sağladığı avantajlara dikkat çekmektedir.

Anahtar Kelimeler: Üçüncü nesil sekanslama, 16S sekanslama, sanger sekanslama, mikrobiyal profilleme, sekanslama yöntemlerinin karşılaştırılması

---

Comparison of 16S rRNA sequencing methods for bacterial identification in clinical microbiology laboratories: Sanger sequencing vs. third-generation sequencing

Süleyman YALÇIN¹, Ayşe Hande TÜRK¹, Hakan Farzin MEHMETZADE¹, Safa Kerem AYDIN³, Ekrem SAĞTAŞ^2
1General Directorate Or Public Health, National Molecular Microbiology Reference Laboratory, Ankara, Türkiye
²General Directorate Of Public Health, Department Of Microbiology Reference Laboratories And Biological Products, General Directorate Of Public Health, Ankara, Türkiye
³Department Of Biological Sciences, Middle East Technical University, Ankara, Türkiye

INTRODUCTION: This study aims to evaluate and compare Sanger sequencing and third-generation 16S rRNA sequencing methods in terms of their ability to accurately identify various bacteria under identical primer sets and specific PCR conditions using four American Type Culture Collection (ATCC) strains. In this context, the capacity of each method was assessed to accurately and comprehensively identify bacteria from pure cultures, where the genus and species of the organisms are confirmed and known.

METHODS: In the study, identical primer sets and PCR conditions were used to enable a comparison between the two sequencing methods. While eight primers targeting the 16S rRNA region were used in the Sanger sequencing method, only two primers were used for the same region in the third-generation 16S rRNA sequencing method. The raw data were analyzed using GeneStudio software for Sanger sequencing and an appropriate bioinformatics workflow for the third-generation 16S rRNAsequencing method.

RESULTS: The analysis demonstrated that third-generation 16S rRNA sequencing outperforms Sanger sequencing in achieving comprehensive and efficient profiling of the full 16S rRNA region. Third-generation 16S sequencing reduces primer requirements, minimizes sequence loss in primer-binding regions, and significantly decreases processing time from days to hours, enabling rapid, high-throughput sequencing in a matter of minutes. In contrast, Sanger sequencing provides high single-read accuracy but falls short in terms of speed and efficiency, making it less suitable for broader applications.

DISCUSSION AND CONCLUSION: This study highlights third-generation 16S sequencing as a faster, more comprehensive, and more effective option for high-resolution microbial investigations. While Sanger sequencing remains a valuable tool for certain scenarios due to its high single-read accuracy, its speed and depth limitations render it inadequate for broader applications. These findings emphasize the advantages of third-generation 16S sequencing in providing scientists with a reliable and thorough approach to characterizing microorganisms for various applications.

Keywords: Third-generation sequencing, 16S sequencing, sanger sequencing, microbial profiling, sequencing method comparison

---

ATIF KOPYALA